La utilización del cultivo de protoplastos en especies frutales está limitada entre otras razones, por la falta de reproducibilidad de los resultados obtenidos previamente. En este trabajo se concluye la importancia de definir con precisión, no solo las condiciones de aislamiento y cultivo de los protoplastos, sino del estado fisiológico del material vegetal, que ha mostrado una gran influencia. La inclusión de pectoliasa entre las enzimas para la digestión de la pared celular en tejidos foliares fue decisiva para el éxito, obteniendo mejores resultados con la combinación de celulasa Onozuka R-10, pectoliasa y macerozima. El número de protoplastos aislados obtenidos aumentó tras someter a los brotes a un periodo de oscuridad de 7 días. Con brotes etiolados, la utilización de la solución M38 para la prepasmólisis y la digestión enzimática aumentó notablemente, tanto el rendimiento, como la viabilidad, que fueron máximas cuando, además, los brotes fueron cultivados en un medio con zeatina. La cefotaxima, aunque no tuvo un efecto en el aislamento de los protoplastos, sí que influyó positivamente en el cultivo de protoplastos permitiendo la división celular y formar grupos celulares de hasta 10 células.